Диагностика злокачественных сужений желчных протоков остаётся сложной задачей. Даже после эндоскопической ретроградной холангиопанкреатографии, биопсии и цитологического исследования врачи не всегда могут сразу определить, вызвано ли сужение опухолью или доброкачественным процессом. Особенно трудно получить точный результат на ранней стадии заболевания или при небольшом количестве доступной ткани.
Новое исследование показало, что дополнительным источником информации может стать желчь, которую получают во время стандартной эндоскопической процедуры. Учёные использовали содержащуюся в ней внеклеточную ДНК и применили сверхнизкопроходное полногеномное секвенирование. Такой подход позволил обнаруживать генетические признаки опухоли, определять её вероятное происхождение и получать дополнительную информацию о прогнозе заболевания.
Желчь превратили в источник геномной информации
При подозрении на опухоль желчных протоков или поджелудочной железы одним из основных методов исследования остаётся эндоскопическая ретроградная холангиопанкреатография. Во время процедуры можно получить клетки для цитологии или небольшой образец ткани, однако даже эти исследования иногда дают неопределённый результат.
Используемый в диагностике опухолевый маркер CA19-9 также не всегда достаточно специфичен. Его концентрация может повышаться не только при раке, но и при застое желчи или воспалительных процессах.
Исследователи предложили использовать клеточно-свободную ДНК, присутствующую непосредственно в желчи. Для анализа требовалось всего около 2 нанограммов генетического материала, а глубина полногеномного секвенирования составляла примерно 0,2×, что значительно меньше стандартного полногеномного анализа.
Основное внимание уделялось крупным изменениям числа копий участков хромосом. По ним исследователи оценивали долю опухолевой ДНК в образце. Если опухолевая фракция достигала не менее 10%, тест считался положительным.
В исследовании участвовали 95 пациентов
В работу включили 95 человек, которым впервые проводили эндоскопическую процедуру из-за выявленного при визуализации подозрительного сужения желчных протоков.
После первоначального патологического исследования 26 случаев были классифицированы как злокачественные, а ещё 69 остались неопределёнными. За пациентами наблюдали до 12 месяцев.
В результате среди первоначально неопределённых случаев ещё 45 оказались злокачественными, а 24 были признаны доброкачественными. В окончательную группу опухолей вошли 40 случаев холангиокарциномы и 31 случай протоковой аденокарциномы поджелудочной железы.
Высокая специфичность и более раннее обнаружение
Среди пациентов, у которых злокачественная опухоль была установлена уже при первом обследовании, анализ ДНК желчи обнаружил опухолевый сигнал в 73% случаев.
Для холангиокарциномы чувствительность достигала 82%, а для протоковой аденокарциномы поджелудочной железы — 56%.
Особый интерес представляли пациенты, у которых первое исследование не позволило поставить диагноз, но впоследствии опухоль всё же была подтверждена. В этой группе чувствительность метода составила 51%.
При этом тест показал высокую специфичность. Из 24 пациентов, у которых в дальнейшем подтвердилось отсутствие злокачественного процесса, 23 получили отрицательный результат. Это соответствует специфичности примерно 96%.
Для сравнения, опухолевый маркер CA19-9 при использованном в исследовании пороговом значении показал специфичность около 53% среди пациентов с доброкачественными заболеваниями.
В 23 случаях новый геномный метод дал положительный результат ещё до того, как опухоль удалось подтвердить стандартными способами. В среднем генетический сигнал появлялся на 38 дней раньше обычного диагноза.
У семи пациентов опухолевая ДНК была обнаружена более чем за 100 дней до подтверждения заболевания, а максимальный интервал достиг 499 дней.
Исследователи также сравнили полногеномный метод с целевым анализом 52 генов. Такой специализированный тест оказался более чувствительным и выявил мутации почти в 95% доступных для анализа злокачественных случаев. Однако сверхнизкопроходное секвенирование требовало меньше ДНК и позволяло одновременно изучать изменения числа копий по всему геному.
Геномный профиль помогает определить происхождение опухоли
Анализ хромосомных изменений показал характерные закономерности, уже известные для опухолей поджелудочной железы и желчных протоков.
Среди часто встречавшихся изменений были потери участков хромосом 9p, 17p и 18q, а также увеличение числа копий областей 7p, 7q, 8q и 19q.
Исследователи разработали классификатор на основе 50 геномных областей, который должен был отличать холангиокарциному от протоковой аденокарциномы поджелудочной железы.
В основной группе его точность составила 86,4%, а в отдельной проверочной группе — 85%. Потеря участка 1p чаще встречалась при опухолях поджелудочной железы, тогда как потеря 9p была характернее для холангиокарциномы.
Авторы считают, что происхождение опухоли лучше определять не по одному конкретному генетическому изменению, а по совокупности хромосомных особенностей.
Совмещение геномных данных может помочь оценить прогноз
Отдельно исследователи изучили связь генетических характеристик с продолжительностью жизни пациентов.
Сама по себе высокая доля опухолевой ДНК или количество мутаций не позволяли надёжно разделить пациентов по прогнозу. Однако сочетание нескольких признаков оказалось более информативным.
У пациентов с выявляемой опухолевой ДНК и мутациями как минимум в трёх исследованных генах медиана общей выживаемости составила около 5,1 месяца. Для остальных участников этот показатель достигал примерно 13,7 месяца.
Даже после учёта первоначального лечения и уровней CA19-9 и раково-эмбрионального антигена такой комбинированный геномный профиль оставался связан с менее благоприятным прогнозом.
Возможная роль в клинической практике
Авторы подчёркивают, что отрицательный результат анализа ДНК желчи не позволяет исключить рак. Чувствительность метода пока недостаточна для того, чтобы он заменил биопсию и гистологическое исследование.
Наиболее перспективным вариантом использования считается дополнительное обследование пациентов после неопределённого результата первой эндоскопической процедуры.
Если анализ ДНК желчи оказывается положительным, врачи могут быстрее назначить повторное получение образца ткани, холангиоскопию, эндоскопическое ультразвуковое исследование с биопсией или более тщательное наблюдение в специализированной группе.
Ещё одним преимуществом является стоимость секвенирования. Снижение глубины анализа со стандартных 30–50× до примерно 0,2× потенциально уменьшает затраты непосредственно на секвенирование примерно в 130–215 раз.
Однако исследование проводилось только в одном центре и включало сравнительно небольшое количество пациентов, особенно в группе с доброкачественными заболеваниями. Кроме того, алгоритм, различающий опухоли желчных протоков и поджелудочной железы, ещё необходимо проверить на независимых группах пациентов.
Поэтому следующим этапом должны стать более крупные многоцентровые исследования. Они должны показать, действительно ли анализ внеклеточной ДНК желчи способен уменьшить число повторных процедур, сократить время до постановки диагноза и в конечном итоге улучшить результаты лечения пациентов.