При острых и опасных инфекциях быстрое определение микроорганизмов в образце пациента может помочь врачам разобраться в причине заболевания и подобрать дальнейшую тактику диагностики и лечения. Для этого используются методы метагеномного секвенирования, которые позволяют анализировать генетический материал всех микроорганизмов в образце и сравнивать его с эталонными геномами.
Однако современные таксономические профилировщики пока не всегда работают достаточно точно. Они могут выдавать ложноположительные результаты или неверно оценивать количество конкретного микроорганизма. Особенно сложно анализировать образцы с очень небольшим количеством микробной ДНК, где настоящий сигнал легко теряется среди генетического материала человека или случайных загрязнений.
Исследователи из Центра инфекционных исследований имени Гельмгольца разработали новый таксономический профилировщик Metax. Его особенность состоит в том, что программа учитывает не только само совпадение последовательностей с эталонным геномом, но и то, как найденные фрагменты распределены по всему геному микроорганизма. Такой подход помогает надёжнее отличать реальное присутствие микроба от случайного совпадения или загрязнения.
Анализ не только совпадений последовательностей
Большинство существующих методов сравнивают прочтения ДНК из образца с эталонными геномами микроорганизмов, хранящимися в базах данных. На первый взгляд задача кажется простой, однако разные микроорганизмы могут иметь очень похожие участки ДНК. Кроме того, сами эталонные геномы иногда содержат посторонние последовательности.
Дополнительным источником ошибок становится микробная ДНК, которая может присутствовать в лабораторных реагентах, используемых при подготовке образцов. Такое загрязнение называют kitome. В результате программа может обнаружить совпадение с геномом микроорганизма, которого на самом деле в исследуемом материале нет.
Разработчики Metax обратили внимание на то, где именно располагаются совпадающие последовательности. Если микроорганизм действительно присутствует в образце, его генетические фрагменты обычно распределены по нескольким различным областям генома.
Ложноположительный сигнал, напротив, часто связан только с одним или несколькими локальными участками. В остальных частях генома подтверждающих прочтений практически нет. Metax использует эту информацию о покрытии генома и благодаря этому лучше отделяет настоящий микробный сигнал от артефактов.
Широкий охват и более точные оценки
Metax способен анализировать сразу несколько крупных групп микроорганизмов. Метод работает с бактериями, археями, грибами и другими эукариотическими микроорганизмами, а также с вирусами. Это позволяет получить более полную картину микробного сообщества в образце и оценить относительное количество различных организмов.
Исследователи проверили Metax на искусственно созданных и реальных данных. В тестирование вошли образцы человеческого микробиома, окружающей среды, сточных вод и клинические материалы.
По результатам сравнений Metax точнее определял присутствующие микроорганизмы и надёжнее оценивал их количество, чем другие протестированные методы. Особенно заметными преимущества оказались в образцах с низкой микробной биомассой.
В таких материалах количество ДНК бактерий, вирусов или грибов может быть чрезвычайно небольшим. При этом значительную часть генетического материала составляет ДНК самого пациента или другие примеси. Поэтому даже слабое лабораторное загрязнение способно исказить результат.
Исследователи сравнивают задачу Metax с поиском микробной иголки в стоге сена: программе необходимо обнаружить небольшой настоящий сигнал среди большого количества постороннего генетического материала.
От мониторинга до диагностики
Точное определение микроорганизмов и их количества может быть полезно сразу в нескольких областях. При исследовании человеческого микробиома более надёжное профилирование способно помочь обнаруживать особенности микробных сообществ, связанные со здоровьем и заболеваниями, а также искать потенциальные биомаркеры.
При мониторинге сточных вод технология может использоваться для наблюдения за патогенами, циркулирующими среди населения. Более точное обнаружение слабых сигналов может помочь заметить появление определённого возбудителя ещё до того, как вспышка станет очевидной по клинической статистике.
В экологических исследованиях Metax позволяет лучше изучать разнообразие микроорганизмов и взаимодействия между ними и окружающей средой. Метагеномные методы особенно ценны здесь потому, что многие микроорганизмы невозможно или очень трудно выращивать в лабораторных условиях.
В клинической метагеномике более точный анализ может помочь искать потенциальных возбудителей инфекций, особенно если микроорганизм присутствует в образце в очень небольшом количестве.
При этом разработчики не рассматривают Metax как замену существующим диагностическим методам. Результаты микробного профилирования должны дополнять стандартные исследования и помогать врачам и учёным оценивать потенциально значимые микроорганизмы.
Дальнейшее развитие Metax
Исследователи намерены продолжить развитие метода и проверить его на дополнительных клинических и микробиомных данных. Особый интерес представляют образцы с очень небольшим количеством микробной ДНК, поскольку именно там вероятность ошибочного определения микроорганизмов особенно высока.
Metax уже доступен исследователям для использования в научных проектах. Авторы рассчитывают, что дальнейшая проверка поможет точнее определить области, где новый подход даёт наибольшее преимущество по сравнению с существующими программами.
Главное отличие Metax заключается в использовании информации о распределении прочтений по всему геному микроорганизма. Вместо того чтобы считать любое совпадение достаточным доказательством присутствия микроба, система проверяет, подтверждается ли этот сигнал в разных областях генома.
Такой подход может сделать метагеномное профилирование более надёжным и снизить количество ложноположительных результатов. Это особенно важно в клинических и исследовательских образцах, где микробного генетического материала крайне мало, а загрязнение или ошибочная классификация способны заметно изменить итоговый вывод.